srb染色法

苏猥琐 3个月前 已收到2个回答 举报

栀初橙澈 2星

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磺酰罗丹明染色法 试验原理:SRB是一种蛋白质结合染料,粉红色,可溶于水。 SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515 nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一个缺点是OD值可随放置时间而变,而SRB法无此现象。

8小时前

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SRB检测方法的原理

磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)比色法,主要用来检测细胞增殖情况。SRB是一种粉红色阴离子染料,易溶于水,在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合;在540 nm波长下产生吸收峰,吸光值与细胞量成线性正相关,故可用作细胞数的定量检测。SRB染色后不会像MTT法那样很容易变色,细胞固定染色后在96孔板中可以放置较长时间,因而受测定时间的影响较小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可稳定较长时间。因此不同时间点固定的96孔细胞培养板可在同一时间测定,测定的吸光值结果不会受到明显影响。吸光值与SRB浓度作图时,在OD单位1.5—2.0以下为线性,当超出线形范围时,最好稀释后重新读数。虽然SRB法比其他检测方法操作步骤繁琐,但是由于时间可以自己掌握,不受限制,因此适用于高通量筛选。

操作步骤

2.SRB检测的操作步骤

1)细胞固定:药物作用时间终点时,每孔加入50μL4℃预冷的TCA溶液(30%,w/v)固定细胞,TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4℃冰箱中固定1 h,取出用去离子水冲洗5遍,室温晾干。

2)染色:待96孔板室温下晾干后,每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70μL,染色30 min后倒掉染液,用1%(v/v)乙酸冲洗4次,去除未结合的染料,室温晾干。

3)检测:用100μL非缓冲Tris-base碱液(10mM,pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料,水平摇床上振荡20min,采用酶标仪540nm处测定光吸收值。操作中,应注意洗除染料时操作需迅速,避免用移液器吸取液体,防止动作过慢造成与细胞蛋白结合的染料解吸附。

计算公式

3.SRB检测的计算公式

根据美国国立癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)关于SRB检测的介绍,细胞增殖百分率的计算存在以下两种情况:

1)Tx-T0>0,

PG=100×(Tx-T0)/(C-T0)

2)Tx-T0<0,

PG=100×(Tx-T0)/T0

其中,

T0:药物作用前的细胞经过固定、染色后测得平均吸光值;

C:培养基中加有等体积的DMSO,没有药物作用的阴性对照的平均吸光值(阴性对照);

Tx:药物作用终点时细胞经过固定、染色后测得平均吸光值。

PG即Percentage Growth,是指药物作用的样品孔与阴性对照孔中细胞增殖量的百分率。

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