pcr引物设计四大原则

pcr引物设计应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

PCR引物设计原则PCR是目前研究DNA、RNA等核酸的非常有效和最主要的方法之一。它的原则主要是在模板cDNA的传统区域内设计方案、引物长短一般在15~30碱基中间、引物GC成分在40%~60%中间，Tm 值最好是贴近72℃、引物3′端要绕开密码子的第3位、引物3′端不可以挑选A，最好是挑选T等等。

首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) ，再次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。引物设计的原则如下。

1，引物最好是在模板cDNA的传统区域内设计方案

DNA序列的传统区是根据种群间类似序列的较为明确的。在NCBI上检索不一样种类的同一遗传基因，根据序列分析系统核对，各遗传基因同样的序列便是该DNA的传统区。

2，引物长短一般在15~30碱基中间

引物长短常见的是18-27bp，但不宜超过38，由于太长会致使其拓宽溫度超过74℃，不适合TaqDNA聚合酶开展反映。

3，引物GC成分在40%~60%中间，Tm值最好是贴近72℃

GC成分过高或过低都不利引起反映。上中下游引物的GC成分不可以相差太多。此外，上中下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链溫度，即在一定含盐量标准下，50%寡核苷酸发夹结构解链的溫度。合理运行溫度，一般高过Tm值5~10℃。若按公式计算：Tm=4（G+C）+2（A+T）可能引物的Tm值，则合理引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好是贴近72℃以使复性标准最好。

4，引物3′端要绕开密码子的第3位

如扩增编号地区，引物3′端不必停止于密码子的第3位，因密码子的第3位易产生简并，会危害扩增的非特异与高效率。

5，引物3′端不可以挑选A，最好是挑选T

引物3′端失衡时，不一样碱基引起高效率存有着挺大的差别，当未尾的碱基为A时，即便 在失衡的情形下，也可以有引起链的生成，而当未尾链为T时，失衡的引起高效率大幅度降低，G.C失衡的引起高效率处于A.T中间，因此 3′端最好是挑选T。

6，碱基要随机分布

引物序列在模板内理应沒有相似度较高，尤其是3’端相似度较高的序列，不然很容易造成不正确引起。减少引物与模板相似度的一种方式 是，引物中四种碱基的遍布最好任意的，不必有聚漂呤或聚嘧啶的存有。特别是在3′端不可高于3个持续的G或C，因那样会使引物在GC聚集序列区不正确引起。

7，引物本身及引物中间不应该存有相辅相成序列

引物本身不可存有相辅相成序列，不然引物本身会伸缩成发夹结构使引物自身复性。这类二级结构会因为室内空间位阻而危害引物与模板的复性融合。引物本身不可以有持续4个碱基的相辅相成。

两引物中间都不应具备多样性，特别是在应防止3′端相辅相成重合以避免 引物二聚体的产生。引物中间不可以有持续4个碱基的相辅相成。

引物二聚体及发夹结构假如必然得话，应尽可能使其△G值不必过高。不然易造成造成引物二聚体带，而且减少引物合理浓度值进而PCR反映不可以正常的开展。

8，引物5′端和正中间△G值应当相比较高，而3′端△G值较低

△G值就是指DNA发夹结构产生需要的活化能，它表明了发夹结构构造內部碱基对的比较可靠性，△G值越大，则发夹结构越平稳。理应采用5′端和正中间△G值相比较高，而3′端△G值较低的引物。引物3′端△G值太高高，非常容易在错孤电子对点产生发夹结构构造并引起DNA缩聚反应。

9.引物的5′端能够 装饰，而3′端不能装饰

引物的5′端决策着PCR物质的长短，它对扩增非特异危害并不大。因而，能够 被装饰而不危害扩增的非特异。引物5′端装饰包含：加酶切位点；标识生物素.莹光.地高辛.Eu3+等；引进蛋白融合DNA序列；引进点突变.插进基因突变.缺少基因突变序列；引进启动子序列等。引物的拓宽是以3′端进行的，不可以实现一切装饰。3′端也无法有产生一切二级结构很有可能。

10，扩增物质的多肽链不可以产生二级结构

一些引物失效的首要因素是扩增物质多肽链二级结构的危害，挑选扩增精彩片段时尽量绕开二级结构地区。用相关手机软件能够预测分析可能mRNA的平稳二级结构，有利于挑选模板。试验说明，待扩地区活化能低于58.6lkJ/mol时，扩增通常无法取得成功。若不可以绕开这一地区时，用7-deaza-2′-脱氨GTP替代dGTP对扩增的完成是有幫助的。

11，引物应具备非特异

引物设计方案进行之后，解决其开展BLAST检验。假如与其他遗传基因不具备多样性，就可以开展下一步的研究了。

值得一提的是，各种各样模板的引物设计方案难度系数不一。有的模板自身标准较为艰难，比如GC成分较高或稍低，造成找不着各种各样标准都十分适合的引物；作为复制目地的PCR，由于物质序列相对性固定不动，引物设计方案的挑选可玩性较低。在这样的状况只有委屈求全，尽可能去符合条件。做RealTime时,用以SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计方案上所规定的主要参数是不一样的。

并且引物设计方案时需要充分考虑引物要有不会受到基因DNA环境污染危害的工作能力，即引物应当跨外显子，最好引物能跨外显子的连接头区，那样还可以更合理的不会受到基因DNA环境污染的危害。