实时荧光pcr基本原理及过程

实时荧光PCR（Real-time PCR）是一种检测DNA扩增的技术，其基本原理是利用荧光探针（例如TaqMan探针、SYBR Green探针等）与PCR反应体系中的DNA结合，产生荧光信号，通过检测荧光信号的强度和变化，可以确定PCR反应过程中DNA扩增的程度和数量。实时荧光PCR的基本过程如下：

DNA模板准备：从样品中提取DNA，并按照需要的扩增区域设计好引物和探针。 

PCR反应：将DNA模板、引物、探针和PCR反应液混合，放入PCR仪中，进行PCR反应。PCR反应过程中，DNA模板会被引物特异性扩增，同时荧光探针会与PCR产物结合，并产生荧光信号。 

荧光信号检测：在PCR反应过程中，PCR仪会周期性地检测PCR反应管中的荧光信号强度，并将荧光信号数据实时传输到计算机上。 

数据分析：通过分析荧光信号的强度和变化，可以确定PCR反应过程中DNA扩增的程度和数量。一般情况下，荧光信号强度与PCR产物数量成正比，因此可以通过测量荧光信号的强度，计算出PCR产物的数量。总之，实时荧光PCR技术可以实现在PCR反应过程中实时监测DNA扩增的数量和程度，具有操作简便、高灵敏度、高特异性等优点，被广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域的DNA分析和检测中。

荧光定量PCR仪原理：

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

荧光定量pcr步骤：

1、配反应体系：引物、模板、buffer，dNTPs,酶，Mg2+,(如果是荧光定量PCR，则还有染料或探针）

2、设置热循环参数，94、55、72等

3、上机实验，如果是荧光定量PCR则实时可以观察实验过程。